NatureMetabolism肝脏A

HepatocyteATF3protectsagainstatherosclerosisbyregulatingHDLandbileacidmetabolism

肝脏ATF3通过调节HDL和胆汁酸代谢预防动脉粥样硬化

这篇文章的通讯作者是东北俄亥俄医学大学的张彦桥教授，他的研究方向是脂质、胆汁酸和/或糖代谢失调相关疾病的发病机制，如脂肪肝、糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化等，主要发的文章是hepetology。

背景

ATF3是转录因子ATF/cAMP反应元件结合家族成员。ATF3结合基因启动子中的一致序列TGACGTCA来调控基因的表达。ATF可以被多种刺激诱导，最常见的是lps，是TLR4的负调节因子，从而抑制炎症基因，防止免疫系统过度反应13,14。它的下游有我们熟知的p53等。

RCT，即：胆固醇逆转运，是机体排除过多胆固醇的唯一途径，也是机体抗AS的重要机制。脂含量过多的巨噬细胞通过胆固醇外流途径以HDL的形式释放脂质，随血液循环至肝脏，和肝脏表面HDL受体，例如SR-B1结合，被选择性摄取后转变成·胆汁酸盐，经粪便排出体外。这里的HDL受体SR-BI被认为是HDL代谢、巨噬细胞反向胆固醇转运(RCT)和动脉粥样硬化的关键调节因子。

在肝脏，游离胆固醇可转化为胆汁酸(BAs)或直接通过胆汁排出。胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)催化BA生物合成经典途径的第一步和限速步骤。CYP8B1是胆酸生物合成的关键酶。BAs合成并分泌到肠道后，95%的BAs被重吸收，这种反馈抑制了CYP7A1和CYP8B1的表达，以防止肝脏中BA的过量产生。Cyp8b1-/-小鼠不能产生CA和其他12α-羟基化的BAs，导致CYP7A1表达增加，BA池大小增加8;而且，12-OH的胆汁酸的减少会导致肠道和胆固醇吸收不良。总结：Cyp8b1/mice9或过表达肝脏CYP7A1的小鼠(参考文献10)对饮食诱导的动脉粥样硬化有抵抗作用，可能是由于诱导肝脏胆固醇转化为BAs和减少胆固醇在肠道的吸收。

慢性压力是动脉粥样硬化的独立危险因素。对于急性或慢性压力的反应，下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴被激活，释放皮质醇和其他激素25。抑制皮质醇合成可以阻止小鼠动脉粥样硬化的发展30。有趣的是，肾上腺功能不全患者与血浆HDL-C水平降低相关，而氢化可的松(HC)治疗这类患者增加血浆HDL-C水平，并呈剂量依赖。到目前为止，对于皮质醇是如何提高血浆HDL-C水平以及血浆HDL-C水平的升高是否与皮质醇诱发的冠心病有关还不清楚。

摘要

结果

结果一HC通过激活cAMP-PKA途径抑制肝脏ATF3的表达

在应对急性或慢性压力时，HPA轴被激活，以促进肾上腺皮质醇的释放。为了研究应激信号是否影响ATF3的表达，我们用HC、地塞米松(DEX)、血管紧张素II(A-II)或胰高血糖素(GCG)处理小鼠或人原代肝细胞。所有这些与应激相关的激素或多肽均显著降低了人和小鼠原代肝细胞中的ATF3mRNA(图1a,b)和蛋白(图1c和扩展数据图1a)水平。有趣的是，已知可以增加细胞内cAMP水平的forskolin(FSK)对ATF3表达也有类似的影响(图1ac和扩展数据图1a)。我们在HepG2细胞中也观察到同样的结果。

与FSK抑制ATF3表达的发现一致，cAMP处理也降低了小鼠、人原代肝细胞和HepG2细胞中ATF3mRNA和蛋白的表达。这些数据表明，应激相关激素可能通过增加细胞内cAMP水平来抑制ATF3的表达。

为了验证后一种假说，我们使用了蛋白激酶A(PKA)抑制剂H89或PKI处理小鼠或人原代肝细胞。h-89和PKI增加了ATF3蛋白的基础表达水平，完全阻断了HC对ATF3mRNA和蛋白表达的抑制作用。

前面是一系列的体外实验，接下来进行体内实验研究皮质醇是否影响ATF3在体内的表达。实验发现：在体内HC也是可以抑制ATF3的表达。HC的处理可以使小鼠血浆HDL-C水平增加60%，但不影响血浆非HDL-C水平，但降低血浆BA水平53%(图1h和扩展数据图1i)。HC对小鼠血浆HDL-C水平的影响与在人类中报道的类似。与血浆HDL-C和BA水平变化一致，HC治疗使肝脏ATF3、SR-BI和CYP7A1蛋白水平分别降低了83%、72%和67%，而使肝脏CYP8B1蛋白水平增加了2.8倍(图1i,j)

在人中是不是也是同样的结论呢？皮质醇也能调节人肝细胞中SR-BI、CYP7A1或CYP8B1的表达。与我们在小鼠研究中的发现一致，HC也抑制了SR-BI和CYP7A1mRNA的表达，但诱导了人原代肝细胞CYP8B1mRNA的表达(图1k)。重要的是，在PKA抑制剂H-89或PKI的存在下，HC对这些基因的调控被取消(图1k)。这些结果说明：皮质醇通过激活cAMPPKA通路调控ATF3、SR-BI、CYP7A1和CYP8B1的表达。

为了研究HC是否是通过ATF3诱导了SR-BI、CYP7A1或CYP8B1的表达变化，我们肝细胞特异性的Atf3敲除小鼠。HC只能在对照鼠，而无法在敲除鼠中导致肝组织SR-BI、CYP7A1和CYP8B1的mRNA和蛋白质的变化(图1l,m和扩展数据图1j),血浆高密度脂蛋白胆固醇水平以及BAs(图1n,o和扩展数据图1k)只有在Atf3fl/fl老鼠而不是L-Atf3/老鼠(图1lo和扩展数据图1j,k)。另外，血浆中ALT和AST含量没有差异，说明HC没有导致肝损伤。

这些结果说明：肝ATF3介导了HC调节HDL-C和BA的过程。

最后，我们探讨了小鼠和人类肝脏ATF3表达与血浆HDL-C水平的相关性。在小鼠中，肝脏Atf3表达降低与血浆HDL-C水平升高相关。人中，患有AJH/PBC的患者肝ATF3的mRNA降低了91%，血浆HDL-C水平增加49.6%。因此，在小鼠和人类中，肝脏ATF3表达与血浆HDL-C水平呈负相关。HC通过cAMP-PKA途径抑制肝脏ATF3，SR-BI和CYP7A1的表达，诱导CYP8B1的表达。肝脏ATF3介导HC对血浆HDL-C和BA水平的影响。并且肝脏ATF3表达和血浆HDL-C水平之间存在很强的负相关。

结果二肝脏ATF3调节血浆HDL-C水平和BA代谢

图1中的数据表明ATF3可能直接调节血浆HDL-C水平。作者通过静脉注射腺病毒，使小鼠过表达hATF3。跟对照小鼠相比,过表达hATF3减低了小鼠肝组织的TC、HDL-C、ALT，不改变TG,non-HDL-C和AST。另外，作者做了RNA-seq分析受hATF3调控的基因。发现：许多基因被ATF3差异调控(扩展数据图2e)，在差异调控基因中，已知的调节脂蛋白、胆固醇或BA代谢的基因数量有限，其中就有(SR-BI)、Ldlr、Apoe、Cyp7a1和Cyp8b1(图2a)。

然后我们进行qPCR和WB来确认RNA-seq数据。hATF3显著诱导SR-BI,Ldlr,ApoeCyp7a1mRNA和蛋白水平，明显压抑Cyp8b1mRna和蛋白质含量。相比之下,没有改变肝Srebf2,Hmgcr或Hmgcs1或肝微粒体TG转运蛋白的蛋白质含量(MTP),阿朴脂蛋白(Apo)B或ApoB48(扩展数据图2h)。

与肝脏CYP7A1表达诱导超过三倍一致(扩展数据图2fi)，血浆BA水平增加了2.3倍(扩展数据图2j)。对胆汁中BA成分的分析显示，ATF3过表达使TUDC和TCDCA水平分别提高了2.6倍和1.7倍，但TCA水平降低了70%(扩大数据图2k)。这些变化与ATF3增加CYP7A1表达，降低CYP8B1表达一致。（12-OH的胆酸减少）但是，ATF3同时抑制了Cyp7a1和Cyp8b1的启动子活性(扩展数据图2l)。对此的解释是：由于ATF3显著抑制CYP8B1的表达(扩展数据图2fi)，ATF3诱导CYP7A1的表达可能是继发于CYP8B1的抑制。

（前面是常规，后面是疾病）为了研究ATF3是否也能调节高脂血症和高血糖小鼠的HDL和BA代谢，我们在糖尿病(db/db)小鼠中静脉注射AAV8-Alb-hATF3或AAV8-Alb-null。

ATF3在肝脏中的过表达降低了血浆TC、HDL-C、非HDL-C、ALT和AST水平(扩展数据图3ad)，但升高了血浆BA水平(扩展数据图3e)。血浆ALT和AST水平的降低提示ATF3可能改善db/db小鼠的肝损伤。此外，ATF3过表达使CYP7A1、SR-BI、LDLR和ApoE蛋白水平增加了两倍以上，而CYP8B1蛋白表达降低了78%(扩展数据图3f,g)。

跟前面过表达相反，作者做了ATF3肝脏敲除鼠的实验，发现ATF3敲除后，血浆中TC,HDL-C升高，non-HDL-C,ALT,AST没变化，另外敲除也导致BA水平下降。同样一致的，是ATF3，CYP7A1，SR-BI分别减低83%,72%and76%，CYP8B1增加%。这些结果说明：ATF3在调节HDL和BA代谢中起到了关键作用。

结果三ATF3是肝细胞体内、体外吸收HDL的关键调节因子

前面的数据显示ATF3是肝脏SR-BI表达的关键调节因子。SR-BI在HDL摄取发挥重要作用,我们发现从对照组小鼠，而不是肝组织Srb1敲除鼠分离的肝细胞，hATF3过表达增加高密度脂蛋白摄取.相比之下，Atf3-/-肝细胞HDL摄取下降，在SR-BI表达恢复到正常水平后，高密度脂蛋白摄取恢复正常(图2b，底部，图2d和扩展数据图5b)。

在HepG2细胞中，当ATF3过表达(图2e)或敲除(图2f)时，也收集了类似的数据。

此外,在LDLR++小鼠中分离的肝细胞中过表达ATF3可以增加LDL摄取，而LDLR敲除小鼠不行。(扩展数据图5c,d,左和右),这也前面的ATF3诱导Ldlr一致。而且，ATF3++和ATF3--小鼠肝细胞摄取LDL没有差别，这和前面chewdirt小鼠敲除ATF3，LDLR表达水平没有变化也是一致的。(扩展数据图4f)。

在HepG2细胞中，ATF3过表达也增加了LDL摄取(扩展数据图5f,g)，而在HepG2细胞中ATF3敲低降低了LDLR的表达和LDL摄取(扩展数据图5h,i)。因此，ATF3在体外调节肝细胞对HDL和LDL的摄取。

为了确定ATF3是否在体内调节肝细胞对HDL的摄取，我们在C57BL/6J小鼠中静脉注射AAV8-Alb-hATF3或AAV8-Alb-null。然后，这些小鼠被静脉注射标记为[14C]胆固醇油酸酯(14C-HDL)的高密度脂蛋白。肝细胞中过表达hATF3使血浆中14c示踪剂水平降低68%(图2g)，但使肝脏中14c示踪剂水平升高17.4%(图2h)，粪便中14c示踪剂水平升高48.6%(图2i)。相比之下，注射14C-HDL的L-Atf3/小鼠血浆中14c示踪剂水平增加了67.8%(图2j)，肝脏(图2k)和粪便中14c示踪剂水平分别减少了25%和57.7%(图2l)。综上所述，图2中的数据表明ATF3通过SR-BI通路在调节肝细胞对HDL-C的摄取中发挥关键作用。

结果四ATF3通过p53调节肝脏SR-BI表达和血浆HDL-C水平

SR-BI对肝细胞从血浆摄取HDL至关重要。ATF3通过SR-BI调控肝细胞对HDL-C的摄取，这一发现促使我们研究ATF3如何调控SR-BI表达和血浆HDL-C水平。p53是一种肿瘤抑制蛋白，曾被证明与ATF3相互作用。作者做了IP实验，发现ATF3与p53共沉淀(图3a)。重要的是，肝脏中p53的过表达使肝脏SR-BI的表达增加了两倍以上(扩展数据图6a)。然后，我们利用p53fl/fl小鼠和肝细胞特异性p53/(L-p53/)小鼠探索p53是否在atf3调节的脂质稳态中发挥作用。肝细胞中ATF3过表达降低了p53fl/fl小鼠的血浆HDL-C水平，但没有降低L-p53/小鼠的血浆HDL-C水平(图3b和扩展数据图6b)。血浆非hdl-c水平无变化(扩展数据图6b,c)。ATF3过表达降低了两种基因型血浆ALT水平，但没有降低AST水平(扩展数据图6d)。

SR-BI对肝细胞从血浆摄取HDL至关重要。ATF3通过SR-BI调控肝细胞对HDL-C的摄取，这一发现促使我们研究ATF3如何调控SR-BI表达和血浆HDL-C水平。p53是一种肿瘤抑制蛋白，曾被证明与ATF3相互作用。作者做了IP实验，发现ATF3与p53共沉淀(图3a)。重要的是，肝脏中p53的过表达使肝脏SR-BI的表达增加了两倍以上(扩展数据图6a)。然后，我们利用p53fl/fl小鼠和肝细胞特异性p53/(L-p53/)小鼠探索p53是否在atf3调节的脂质稳态中发挥作用。肝细胞中ATF3过表达降低了p53fl/fl小鼠的血浆HDL-C水平，但没有降低L-p53/小鼠的血浆HDL-C水平(图3b和扩展数据图6b)。血浆非hdl-c水平无变化(扩展数据图6b,c)。ATF3过表达降低了两种基因型血浆ALT水平，但没有降低AST水平(扩展数据图6d)。在肝脏中，ATF3过表达使p53fl/fl小鼠的肝脏SR-BI蛋白表达增加了三倍，而在L-p53/小鼠中则没有该变化(图3c,d)。

由于图1的数据显示ATF3是HC的下游靶点，我们继续研究p53是否介导了HC对SR-BI表达的影响。与预期的一样，HC提高了p53fl/fl小鼠血浆HDL-C水平，抑制了肝脏SR-BI的表达;然而，这些变化在L-p53/小鼠中被消除(图3e,f和扩展数据图6e)。另外，两组的ALT和AST没有变化。这些数据表明，肝细胞p53对HC和ATF3调控肝脏SR-BI表达和血浆HDL-C水平具有重要作用。

为了了解p53和ATF3如何协同调控SR-BI的表达，我们使用一系列截断的SR-BI启动子构建进行了转染试验。p53(图3g)或ATF3(扩展数据图6g)的过表达显著诱导了SR-BI的启动子活性。当p53结合位点发生突变时，这种诱导被取消(图3h)。为了证实我们的转染试验结果，我们还进行了电泳迁移率转移试验(EMSAs)和染色质免疫沉淀试验(ChIP)。EMSA用来确认p53在Srb1启动子的结合位置。我们的EMSA数据显示，p53蛋白与含有野生型(WT)SR-BI序列的DNA寡核苷酸结合，而这种结合被过量含有WT而不是p53结合位点突变的DNA寡核苷酸所击败(图3i)。此外，DNA蛋白复合物在抗p53抗体存在下进行了超移位(图3i)。相反，在EMSA研究中，ATF3蛋白单独无法与SR-BI启动子的近端结合(扩展数据图6h)。ChIP测定结果显示，在肝脏中，p53(图3j)或ATF3(图3k)蛋白被发现与SR-BI的近端启动子结合。这些数据表明ATF3通过与p53相互作用与SR-BI的启动子结合。综上所述，图3中的数据表明，ATF3通过与p53相互作用调节肝脏SR-BI表达和血浆HDL-C水平。

结果五ATF3在肠道脂肪胆固醇吸收和巨噬细胞RCT中是必不可少的

除了调节SR-BI表达和血浆HDL摄取,我们的数据也表明,肝ATF3调节CYP7A1CYP8B1表达和BA组成。因此，我们假设ATF3可能调节肠道脂肪和/或胆固醇的吸收。为了验证我们的假设，我们在小鼠肝细胞中过表达或敲除Atf3。hATF3过表达显著降低了肠道胆固醇和脂肪吸收(图4a、b和扩展数据图7a)。还通过腹腔注射带有乙酰化LDL和[3H]胆固醇的巨噬细胞来测量巨噬细胞RCT。肝细胞中过表达hATF3使血浆3h示踪剂水平降低56%，但使肝脏和粪便中的3h示踪剂水平分别提高%和%(图4c)。

相反，肝细胞中Atf3的敲除显著增加了胆固醇(图4d)和脂肪的肠道吸收(图4e和扩展数据图7b)。在RCT研究中，Atf3敲除使血浆3h示踪剂水平提高了%，但使肝脏和粪便中的3h示踪剂水平降低了31%(图4f)。数据表明肝细胞ATF3是肠道脂肪和胆固醇吸收以及巨噬细胞RCT的关键调节因子。BA信号通路可调节肝脏VLDL分泌45。因此，我们确定了肝脏ATF3在VLDL分泌中的作用。肝细胞中过表达hATF3减少了VLDL的分泌(扩展数据图7c)，而肝细胞ATF3的缺失增加了VLDL的分泌(扩展数据图7d)，表明肝细胞ATF3在抑制VLDL分泌方面发挥重要作用。

结果六ATF3通过ATF3-HNF4α-CYP8B1通路抑制肠道脂肪和胆固醇吸收

之前有报道说：cyp8b1敲除小鼠会减少肠道脂肪和胆固醇的吸收。而我们前面有数据说明：ATF可以抑制cyp8b1的表达，这让我们提出一个猜测：ATF是通过cyp8b1介导完成了降低肠道脂肪和胆固醇的吸收的过程。为了验证这个假说，作者通过注射腺病毒过表达了ATF3或cyp8b1，发现：ATF3过表达导致肝脏CYP8B1表达降低，经aav介导外源性CYP8B1表达后，肝脏CYP8B1表达恢复正常。而且，cyp8b1表达恢复正常后可以抑制ATF3诱导的cyp7a1表达、恢复肠道胆固醇和脂肪吸收。这些说明：ATF3通过抑制CYP8B1降低肠道脂肪和胆固醇的吸收，并且ATF3对CYP7A1的诱导是继发于对CYP8B1的抑制。ATF3过表达降低了血浆ALT水平，但不会降低AST水平(扩展数据图8a)。

接下来，我们研究了ATF3如何抑制CYP8B1的表达。肝细胞核因子4α(Hepatocytenuclearfactor4α，HNF4α)在肝脏中富集，在调节CYP7A1和CYP8B1表达中发挥重要作用46。HNF4α结合Cyp8b1近端启动子的特定元素来调节其表达46。因此，我们测试了HNF4α是否参与atf3介导的CYP8B1调控。正如预期的那样，在Hnf4afl/fl小鼠中，ATF3过表达抑制了CYP8B1蛋白的表达，增加了CYP7A1蛋白的表达;但这些变化在(L-Hnf4a/)小鼠中被消除(图5d,e)，表明肝细胞HNF4α对ATF3抑制CYP8B1表达或诱导CYP7A1表达很重要。（相比之下，ATF3过表达降低了Hnf4afl/fl小鼠和L-Hnf4a/小鼠血浆ALT和HDL-C水平，而组间血浆AST水平没有变化(扩展数据图8b,c)。）为了确定ATF3和HNF4α如何协调抑制Cyp8b1的表达，我们生成了一系列截断Cyp8b1启动子构建物，并进行瞬时转染试验。我们的数据显示0.19kb到0.kb之间的启动子区域对ATF3抑制Cyp8b1的表达很重要(图5f和扩展数据图8d)。

hnf4α-结合位点的突变消除了ATF3对Cyp8b1启动子活性的抑制作用(图5g)。重要的是，显性阴性(DN)形式的HNF4α47也可消除ATF3对Cyp8b1启动子活性的抑制作用(图5h)。与这些发现一致的是，在共免疫沉淀(co-IP)试验中，ATF3蛋白与HNF4α发生了物理相互作用(图5i)。chip分析显示ATF3蛋白与肝脏Cyp8b1启动子的近端启动子(0.1~0.kb)结合(图5j)。这些数据表明ATF3通过直接与HNF4α相互作用抑制Cyp8b1的表达。

我们还研究了ATF3如何诱导CYP7A1的表达。前面有数据表明：ATF3抑制了cyp7a1的启动子活性，这说明ATF3通过间接的方式诱导Cyp7a1的表达。FXR通过上调FGF15和SHP在抑制CYP7A1表达中发挥重要作用。然而，ATF3过表达诱导了肠道Fgf15的表达，而没有影响肝脏Shp的表达(扩展数据图8e)，这表明FXR信号通路可能没有参与ATF3介导的CYP7A1表达诱导。肝脏X受体α(LXRα)可诱导CYP7A1表达。有趣的是，ATF3诱导肝脏LxrαmRNA水平，当肝脏中CYP8B1过表达时，这一上升水平被消除(扩展数据图8f)，表明ATF3对Lxrα的诱导是继发于对CYP8B1的抑制。肝脏中敲低LXRα不影响Cyp8b1的表达，但这时ATF3过表达无法诱导Cyp7a1表达上升(图5k)。这些数据表明ATF3通过一种涉及LXRα的机制诱导肝脏CYP7A1的表达。最后，我们通过FXR+/+和FXR/小鼠来确定FXR信号通路是否参与atf3介导的肠道胆固醇和/或脂肪吸收抑制。我们的数据显示，不管FXR敲不敲除，ATF3过表达都可以抑制了两种基因型的肠道胆固醇(扩展数据图8g)和脂肪(扩展数据图8h)吸收，都可以诱导Cyp7a1表达，抑制Cyp8b1表达(图5l)。这些数据表明ATF3抑制肠道脂质吸收和肝脏CYP8B1的表达，并诱导肝脏CYP7A1独立于FXR的表达。显示ATF3抑制肠道吸收脂肪和胆固醇通过ATF3HNF4αCYP8B1通路。

结果七ATF3在不诱导LDLR或ApoE的情况下抑制动脉粥样硬化的发展

前面的研究结果：肝细胞ATF3过表达增加血浆HDL摄取和巨噬细胞RCT，但降低肠道脂肪和胆固醇吸收，提示ATF3可能阻止动脉粥样硬化的发展。另外，前面也有数据说明：ATF3的过表达可以提高LDLR和APOE的表达，提高LDL的吸收。为了说明：ATF3过表达能不能预防AS，以及LDLR和APOE在其中起到的作用，作者对LDLR-/-和APOE-/-小鼠上了西方饮食。Apoe/小鼠肝细胞中hATF3过表达在不影响进食或体重的情况下，使肝脏ATF3、SR-BI、CYP7A1和LDLR蛋白水平增加2.5-3.5倍，并使肝脏CYP8B1蛋白水平降低82%，降低血浆TC、LDL-C水平(扩展数据图9b)、HDL-C、non-HDL-C(Fig.6d),TGs，ApoA-IandApoB。

ATF3降低了血浆中VLDL-C、LDL-C和HDL-C水平(扩展数据图9d)以及VLDL-TG水平(扩展数据图9e)。ATF3过表达也降低了血浆ALT和AST水平(扩展数据图9f)，表明ATF3过表达可防止Apoe/小鼠肝损伤。最显著的是，过表达hATF3使en面主动脉斑块大小减少了74%(图6f,g)，使主动脉根部斑块大小减少了56%(图6h,i)。ATF3还减少了主动脉根部病变中巨噬细胞的浸润57%(扩展数据图9g,h)。

前面的是ApoE-/-小鼠，接下来的部分是LDLR-/-小鼠，结果跟前面一致。当hATF3在Ldlr/小鼠的肝脏中过表达时，所获得的数据与Apoe/小鼠的数据相似。ATF3过表达可诱导肝脏ATF3、SR-BI、CYP7A1和ApoE蛋白水平提高2.97.4倍，但抑制CYP8B1蛋白表达57%(图6j,k)，而食物摄取量和体重未发生变化(扩展数据图9i)。ATF3还降低血浆HDL-C、非HDL-C、TG、TC、LDL-C、ApoA-I和ApoB水平(图6ln和扩展数据图9jm)，降低血浆ALT和AST水平(扩展数据图9n)。

此外，ATF3过表达使en面主动脉(图6o,p)或主动脉根部(图6q,r)病变大小分别减小53%和50%。

前面是分别敲除LDLR或APOE小鼠，最后是同时敲除这两者的小鼠。AAV8-mediatedATF3并不影响的过度进食或身体体重增加(扩展数据图9o)，和前面的方式一样调节TC,LDL-C,HDL-C,non-HDL,TG,ApoA-IandApoB,lipoproteinprofiles，ALTandAST。

重要的是，ATF3将面主动脉和主动脉根部的动脉粥样硬化病变分别减少了67.5%和44%(图6wz)，，肝细胞ATF3过表达可通过一种独立于APOE或LDLR诱导的机制显著减弱动脉粥样硬化的发展。

结果八

前面的数据显示，肝细胞ATF3的丢失降低了血浆HDL的摄取和巨噬细胞RCT，但增加了肠道脂肪和胆固醇的吸收。这里A图，在western-日粮喂养的WT、Apoe/或Ldlr/小鼠中，肝脏ATF3蛋白水平显著降低(扩展数据图10a)。这些数据表明，肝ATF3缺失可能在动脉粥样硬化的发病机制中发挥作用。

为了验证这一假设，我们产生了Apoe-/-，ATF3-/-小鼠，westerndiet3月。ATF-/-小鼠肝脏ATF3、SR-BI和CYP7A1蛋白水平分别降低了81%、66%和78%，而肝脏CYP8B1蛋白水平升高了%(图7a、b)。与基因表达数据一致，L-Atf3/患者血浆TC(扩展数据图10b)、HDL-C(图7c)、非HDL-C(图7d)和TG(图7e)水平分别升高了%、%、%和%;肝Atf3敲除导致血浆中VLDL-C、LDL-C和HDL-C水平升高(扩展数据图10c)，以及VLDL-TG水平升高(扩展数据10d)，还增加了血浆ALT和AST水平(扩展数据图10e)。

重要的是，肝细胞ATF3的丢失使en面主动脉(图7f,g)和主动脉根部(图7h,i)的斑块大小分别增加了%和%。因此，肝细胞ATF3的丢失加重了动脉粥样硬化的发展。

总结

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