JCI解锁动粥新靶点研究揭示Nck1在

动脉粥样硬化是一种慢性脂质驱动的动脉炎症性疾病，发生在局部内皮激活位点，促使内皮细胞表型发生炎症反应。局部血流动力学剪切应力是血液在内皮上的摩擦力，有动脉粥样硬化保护作用的层流限制了内皮细胞的激活；而动脉粥样硬化的干扰流会刺激内皮细胞的激活，以细胞骨架重塑、内皮硬化和NF-κB驱动促炎因子产生为主要特征。

被激活的内皮细胞从循环中招募单核细胞，在高胆固醇血症的背景下，这些单核细胞积累脂质驱动早期脂肪条纹形成；招募平滑肌细胞有助于动脉粥样硬化的形成，并驱动富含胶原的保护性纤维帽的产生，从而限制斑块破裂的脆弱性。

Canakinumab抗炎血栓形成的最新研究结果(CANTOS)强调了：在动脉粥样硬化治疗中限制炎症的重要作用，虽然确立了炎症治疗在动脉粥样硬化中的作用，但我们对动脉粥样硬化易发部位内皮激活的了解仍然有限。

MabrukaAlfaidi等研究者于年5月19日在TheJournalofClinicalInvestigation上发表题名为“SelectiveroleofNck1inatherogenicinflammationandplaqueformation”的研究文章，揭示了内皮细胞Nck1靶点的激活诱导NF-κB驱动促炎因子表达，从而促进动脉粥样硬化部位炎症的发生和斑块的形成。

（图片来源：TheJournalofClinicalInvestigation）

接头蛋白Nck家族(Nck1和Nck2)广泛表达，并共享约68%的氨基酸。Nck接头蛋白缺乏酶活性，但可以通过三次串联Src同源性域(SH3)和一个c端SH2域控制信号复合物的形成。SH2结构域与酪氨酸磷酸化蛋白高度结合，而SH3结构域与信号伙伴富含脯氨酸的序列(PXXP)结合，表明Nck将酪氨酸激酶信号通路与下游通路的激活结合起来。

Nck1和Nck2在视网膜病变小鼠模型中发挥着调节血管生成的作用，Nck2可能在pdgf诱导的NIH3T3细胞肌动蛋白聚合中起主导作用。相比之下，Nck1在T细胞受体诱导的ERK激活中发挥了更主要的作用，以及在表型调控发育后的非补偿作用。然而，Nck1/2在细胞骨架重塑之外的信号传导作用尚不完全清楚。在此，研究人员利用细胞培养、紊乱血流的动物模型和高脂饮食诱导动脉粥样硬化的模型探究Nck1和Nck2在干扰血流诱导的内皮激活中的作用。

为研究Nck1和Nck2的作用，研究人员首先采用特异性的Nck1/2siRNA转染人主动脉内皮细胞(HAECs)。HAECs在指定时间内承受急性剪应力，然后使用Westernblotting检测NF-κB及其磷酸化蛋白的表达。Nck1/2siRNA和对照组细胞在45分钟剪切应力后测量p65核易位。用Nck1/2siRNA和振荡剪切应力(OSS)诱导促炎基因表达(VCAM-1,ICAM-1)和促炎信号(P-NF-κBSer)产生，采用Westernblotting、q-PCR检测mRNA表达情况。

急性剪应力作用下的内皮细胞表现出促炎信号的早期上调，部分由NF-κB介导的细胞骨架排列信号通路驱动，因此，当细胞适应层流时，这些信号会减弱，但由于细胞无法适应，这些信号会维持在紊流中。由于内皮细胞对剪应力的急性反应模拟了慢性干扰血流中观察到的持续信号传导，因此内皮细胞受到0、5、15或30分钟的急性剪应力后，测量早期信号传导效应，结果表明Nck1/2敲除的细胞均显著显示了NF-κB磷酸化和核易位。

Nck1/2缺失改善剪切应力诱导的NF-κB激活

振荡剪切应力干扰的细胞诱导NF-κB激活从而驱动促炎因子ICAM-1和VCAM-1的表达。研究发现Nck1/2基因沉默之后，这两种促炎因子表达水平均显著下调。

以上的结果数据表明，Nck1/2是驱动NF-κB激活和促炎因子表达的关键蛋白。

尽管Nck1和Nck2蛋白通过不同的基因表达，但它们具有高度的序列一致性，通常认为它们的功能是重叠的。然而，新出现的证据表明这两种异构体在多种反应中有独立的贡献，包括T细胞激活、细胞质分裂和细胞骨架动力学。为了探究Nck1和Nck2的选择性作用，研究人员使用干扰RNA分别构建Nck1和Nck2的沉默细胞模型。

使用Nck1和Nck2构建HAECs的细胞沉默模型，振荡剪切应力造模18小时后,检测促炎信号(NF-κB)和促炎基因表达(VCAM-1/ICAM-1)。通过检测NF-κB磷酸化蛋白、核转运来评估NF-κB激活效应。

Nck2的缺失不能改善剪切应力诱导的NF-κB激活

在剪切应力的作用下，Nck1缺失的细胞表现出NF-κBp65磷酸化和核易位明显的减少，而Nck2缺失并不影响NF-κB激活。

结果显示，Nck1沉默后促炎信号和促炎基因表达被抑制，而Nck2沉默后并没有此抑制作用。这些数据确证了Nck1作为NF-κB激活和炎症基因表达的关键调节器，Nck1在动脉粥样硬化的内皮激活中起关键作用，而Nck2没有作用。

已经明确Nck1在体外调节内皮细胞的激活，研究人员试图在扰动流的体内模型中研究Nck1和Nck2的差异效应。使用他莫昔芬诱导产生的内皮特异性小鼠、Nck1全敲小鼠、Nck2内皮特异性敲除小鼠和内皮特异性双敲Nck1/2小鼠，采用部分颈动脉结扎术(PCL)以诱导特定于左颈动脉的干扰血流的内皮激活，48小时后评估内皮mRNA表达的变化，7天后评估炎症基因表达和巨噬细胞募集的变化。

根据动物基因型和手术时间对iEC-Control、Nck1KO、iEC-Nck2KO和iEC-Nck1/2DKO四组小鼠进行结扎手术，检测ICAM-1和ICAM-1的表达水平。

敲除Nck1而非Nck2可以减轻部分颈动脉结扎引起的炎症

Nck1敲除组血流干扰诱导的VCAM-1和ICAM-1mRNA表达显著降低。然而，Nck2缺失的iEC-Nck2KO小鼠并不影响VCAM-1和ICAM-1的表达，并且与Nck1KO小鼠相比，iEC-Nck1/2DKO小鼠的VCAM-1/ICAM-1mRNA表达没有显著降低。

为了检查结扎后的颈动脉早期的致动脉粥样硬化，研究者收集结扎后7天的组织，并通过免疫组织化学方法评估炎症标志物。

各实验组免疫组化结果，巨噬细胞(Mac2，绿色)、平滑肌细胞(SMA，红色)

和内皮细胞(vWF，白色)

与mRNA检测结果一致，同样，与iEC对照组小鼠比较，Nck1KO小鼠显示内膜巨噬细胞募集显著减少(Mac2阳性区域)，Nck1KO也显著降低了外膜巨噬细胞的含量。但内皮细胞Nck2缺失不影响内膜或外膜巨噬细胞浸润。

综上，所有研究数据表明，在动脉粥样硬化血流动力学下，Nck1在调节内皮激活和巨噬细胞募集方面具有直接作用。

动脉粥样硬化血流量对内皮激活和饮食引起的动脉粥样硬化斑块发展具有敏感性，观察到Nck1和Nck2对动脉粥样硬化血流量诱导的内皮激活的不同作用，研究人员试图确定Nck1KO小鼠的动脉粥样硬化斑块发展是否发生改变。iEC-Control、Nck1KO、iEC-Nck2KO或iEC-DKO小鼠喂食高脂肪食物(HFD)12周，诱导自发性动脉粥样硬化。

四个组的小鼠进行高脂饮食(HFD)喂养12周，在四个不同的血管部位评估动脉粥样硬化病变的形成，包括主动脉、主动脉根、头臂动脉和左右颈动脉窦。通过油红O染色对主动脉粥样硬化的表面分析进行评估，并计算出病变面积与主动脉总表面积的百分比。采用苏木精和伊红(HE)检测全主动脉粥样硬化(占总表面积的%)，斑块进行免疫组化检测：巨噬细胞染色(Mac2阳性区域)和平滑肌(SMA阳性区域)水平。

Nck1的整体缺失而非Nck2的缺失可以减轻高脂肪饮食引起的动脉粥样硬化

虽然iEC-Nck2KO小鼠与iEC-对照没有差异，但Nck1KO小鼠显示主动脉、颈动脉窦、头肱动脉斑块负担显著减少，Nck1KO小鼠的血浆中几种促炎介质的水平显著降低，包括IL-1β、TNF-α和MCP-1。与Nck1KO相比，iEC-Nck1/2DKO中动脉粥样硬化没有进一步减少，提示Nck1是关键调控因子，而内皮Nck2对动脉粥样硬化性内皮激活没有显著作用。

与前面研究结果一致，Nck1KO小鼠颈动脉窦和头臂动脉巨噬细胞面积显著减少。头臂动脉和颈动脉窦的动脉粥样硬化病变往往不如主动脉根部的斑块发育，这可能是由于这些部位斑块形成的延迟。然而，形成的斑块显示巨噬细胞面积减少和增强的平滑肌面积，提示斑块稳定性增强。

为了确定血管细胞或骨髓细胞中Nck1缺失对动脉粥样硬化形成的相对作用，研究者进行了骨髓移植实验，将Nck1KO或Nck1WT骨髓移植到辐照下Nck1KO或Nck1WT接收者。

Nck1野生型(WT)和Nck1KO小鼠分别接受Nck1WT和Nck1KO的骨髓。照射2周后，四组小鼠给予HFD喂养12周。同样，检测全主动脉病变面积、巨噬细胞(Mac2，绿色)和平滑肌细胞(SMA，紫色)募集变化，分析斑块细胞含量。

血管壁Nck1缺失具有动脉粥样硬化保护作用，而造血细胞Nck1缺失不具有动脉粥样硬化保护作用

与内皮激活的体外观察一致，Nck1KO小鼠在使用Nck1WT骨髓重建后，仍显示主动脉粥样硬化显著减少，而接受Nck1KO小鼠骨髓的Nck1WT小鼠与接受Nck1WT骨髓的Nck1WT小鼠没有显著差异。同样，颈动脉和头臂动脉粥样硬化与对照组相比，接受Nck1WT骨髓的Nck1KO小鼠的病灶减少了2-3倍。横断面分析颈动脉和BCA病变中Mac2和SMA阳性区域显示，只有当Nck1在血管细胞中消失时，颈动脉Mac2和SMA区域明显减少，而骨髓中Nck1消失时则没有变化。这些数据支持了血管壁Nck1在致动脉粥样硬化炎症和动脉粥样硬化斑块发展中的作用，并提示骨髓系Nck1的表达与动脉粥样硬化斑块的形成无关。

总体来说，这项研究证明了Nck1接头蛋白在受血流干扰诱导的内皮激活作用。尽管Nck1与Nck2具有高度的相似性，但只有Nck1的缺失能够抑制NF-κB的激活和促炎基因的表达。Nck1基因敲除小鼠在紊乱血流和高脂肪饮食诱导的动脉粥样硬化模型中均显示内皮激活和炎症减少，而Nck2缺失则没有该效应。

参考文献：

AlfaidiM,AcostaCH,WangD,TraylorJG,OrrAW.SelectiveroleofNck1inatherogenicinflammationandplaqueformation.JClinInvest.;.Doi:10./JCI