PFKFB3的抑制会阻碍动脉粥样硬化的进

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KeyLaboratoryofBiodiversityFormationMechanismandComprehensiveUtilizationofQinghai-TibetanPlateauinQinghaiProvince

概述

OVERVIEW

FrontiersinCellandDevelopmentalBiology上刊载了DepartmentofExperimentalVascularMedicine,JeffreyKroon(j.kroon

amsterdamumc.nl)研究团队发布的"InhibitionofPFKFB3HamperstheProgressionofAtherosclerosisandPromotesPlaqueStability"(doi:10./fcell..)在本研究中，分析了人动脉粥样硬化病变中的基因表达，并探讨了基因在实验性动脉粥样硬化中的治疗潜力。

前言TNTRODUCTION近年来，动脉粥样硬化的发展与明显的代谢细胞改变相一致。其中，炎症刺激改变了参与动脉粥样硬化形成的多种细胞类型的细胞内代谢，例如巨噬细胞和内皮细胞。这些细胞的能量代谢高度依赖糖酵解来调节细胞功能。糖酵解的这种诱导作用发现在可以在内皮受到剪切应力干扰的区域，这使得这些早期损伤容易受到脂蛋白如低密度脂蛋白(LDL)和脂蛋白(a)[Lp(a)]已有研究表明，Lp(a)等致动脉粥样硬化刺激可通过上调葡萄糖转运蛋白(GLUT)1和己糖激酶(Hk)II等关键糖酵解因子来诱导内皮细胞活化。这种糖酵解转换主要依赖于酶6-磷酸果糖2-激酶/果糖-2，6-双磷酸酶(PFKFB3)。相反，PFKFB3的抑制导致体外内皮细胞和免疫细胞脂蛋白诱导的炎症信号显著减少，表明PFKFB3在糖酵解和炎症间起着关键作用。此外，Apoe?/?小鼠通过沉默PFKFB3糖酵解的部分导致动脉壁糖酵解减少。然而，目前还不知道糖酵解抑制如何影响动脉粥样硬化的进展。方法METHOD

1.人冠状动脉斑块的免疫组织化学分析

在阿姆斯特丹大学医学中心(荷兰阿姆斯特丹)病理科进行尸检期间，在获得受试者的知情书面同意后，获得人冠状动脉样本，并立即固定在10%福尔马林中，进行石蜡包埋处理。组织的使用符合《荷兰人体组织二次正确使用守则》，并符合《赫尔辛基宣言》中概述的原则。如前所述，根据纤维帽形成和坏死核心大小，标本分为初始或晚期病变。用免疫组织化学方法分析PFKFB3的表达。脱蜡后，在甲醇中封闭载玻片的内源性过氧化物酶活性，之后进行热诱导抗原回收。然后在室温下用1:稀释的兔抗人PFKFB3抗体(Abcam，AB)覆盖载玻片一小时。在用Tris-Hclbufferedsaline(TBS)洗涤后，将第二种山羊抗兔生物素标记抗体(Dako，E)以1:的比例引入载玻片30分钟，然后用1:的ABC-HRP(对于DAB)或ABCAP试剂盒(对于载体蓝)(载体PK-6，AK-)孵育30分钟。用DAB(矢量SK-)对PFKFB3进行可视化。对于双重染色，用载体蓝(载体，SK)显现PFKFB3，随后用4%FCS封闭30分钟，并进行额外的热诱导表位回收。使用CD68(小鼠抗人，Abcam，ab，1:)、CD3(大鼠抗人，AbD血清型，MCA，1:)、αSMA(小鼠抗人，SigmaAldrich，F，1:5，)和CD31(小鼠抗人，Novus生物制品，NBP2-，1:)，在室温下均持续1小时。载玻片在1:ABC-HRP试剂盒(载体实验室)中覆盖30分钟。用免疫AMEC红(载体，SK-)显现表位。载玻片分析在徕卡DM3显微镜上用DFC相机进行，进一步分析使用AdobePhotoshopCS6、ImageJ和Las4.1软件(徕卡)进行。2.动脉粥样硬化表达生物库的颈动脉内膜切除术标本动脉粥样硬化-快速生物库研究设计和斑块处理以前已有报道。斑块是从接受颈动脉内膜切除术的患者中随机选取的。通过使用带有偏振光的胡黄连红色与苏木精染色相结合的目测方法来估计动脉粥样硬化的百分比。基于斑块中存在的粥样斑块的百分比，考虑了三组(每组10个):含10%脂肪的纤维斑块；纤维动脉粥样化，10-40%；或者动脉粥样化，40%脂肪。接下来，斑块易损性的累积评分通过对巨噬细胞、胶原蛋白、平滑肌细胞含量和斑块内出血进行评分来确定。该斑块易损性指数评分如下:巨噬细胞:无/轻度(0分)、中度/重度(1分)；胶原蛋白:中度/重度(0分)，无/轻度(1分)；平滑肌细胞:中度/重度(0分)，无/轻度(1分)。如前所述，左心耳内出血分为无出血(0分)或有出血(1分)。切片随后如前所述进行染色。斑块切片在二甲苯中脱蜡，并在分级浓度的乙醇(-70%乙醇)中脱水。在用5%牛血清白蛋白在tris缓冲盐水(TBS)中封闭切片20分钟之前，进行热诱导表位回收。接下来，将切片在室温下与下列主要抗体一起孵育2小时:PFKFB3兔抗人(Abcam，AB)、CD68(Invitrogen，MA1-)和血管性血友病因子小鼠抗人(Agilent，AB)。接下来，切片在黑暗中用生物素化的二级抗体在室温下孵育:山羊抗鼠Alexa(ThermoFisherSciental，AB)、山羊抗鼠Alexa(ThermoFisherSciental，AB)和山羊抗鼠Alexa(ThermoFisherSciental，AB)。孵育1小时后，切片用含有DAPI(安捷伦)的DAKO固定介质固定。使用徕卡TCSSP8共焦激光扫描显微镜对切片进行成像，并使用徕卡LAS-X软件(德国威兹拉尔徕卡相机)进行量化。所有患者都提供了书面知情同意书。Athero-Express研究方案符合赫尔辛基宣言，并已获得该机构人类研究伦理委员会的批准。3.动物实验

雄性Ldlr?/?小鼠在当地动物设施中繁殖和饲养，具有正常的光/暗周期，并随意喂食0.15%胆固醇饮食。在16周龄时，在早晨每周3次给小鼠注射PFK(2mg/kgip)或赋形剂对照(0.1%DMSO)，持续5周。小鼠通过单次腹腔注射30毫克/千克赛达姆(xylazine20mg/ml)和毫克/千克阿奈克汀(氯胺酮毫克/毫升)的混合物进行安乐死，并通过心脏穿刺证实死亡。所有实验均由荷兰阿姆斯特丹大学动物福利委员会批准(协议-AW-1)，并符合关于实验室动物保护的指令/63/EU中确定的欧洲法规。

4.快速蛋白质液相色谱法分离脂蛋白

血液通过静脉或心脏穿刺获得，并收集到含有乙二胺四乙酸(乙二胺四乙酸)的试管中。如前所述，通过快速高效液相色谱(FPLC)测定个体脂蛋白水平。使用FPLC法测定主要脂蛋白类(极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白)中总胆固醇和甘油三酯的含量。主系统包括一个带有LG--02线性脱气器的聚氨酯-三重泵和一个紫外-紫外/可见检测器(日本东京雅士高)。注射30升血浆(用三丁基锡化合物以1:1稀释)后，使用超数6倍10/30柱分离脂蛋白(荷兰赫韦拉肯医疗保健公司)。以0.31毫升/分钟的流速使用pH7.4的三丁基锡化合物作为洗脱剂。第二个泵(PU-iPlus，Jasco，日本东京)用于在线添加胆固醇PAP或甘油三酯酶底物试剂(Sopachem，Ochten，荷兰)，流速为0.1毫升/分钟，便于进行总胆固醇或总胆固醇检测。商业上可获得的脂质血浆标准(低、中和高)被用于生成用于分离的脂蛋白组分的定量分析(SKZL，Nijmegen，荷兰)的TC或TG校准曲线。对色谱图进行的所有计算均使用ChromNav色谱软件1.0版(日本东京Jasco)进行。

5.组织学

在21周龄时，处死小鼠，用PBS和1%多聚甲醛灌注动脉。主动脉弓和器官在多聚甲醛中分离和固定。主动脉弓的纵向切片(4μm)(n=10/组)和主动脉根部三个瓣膜区的切片(n=14/组)用苏木精和曙红染色，并如前所述分析斑块范围和表型。一只小鼠因位置倒置而被排除在主动脉弓分析之外。坏死核心测量仅在晚期斑块中进行。内膜黄色瘤(IX)定义为由泡沫细胞组成的小病变，其中不能检测到细胞外脂质积聚，病理性内膜增厚(PIT)定义为主要由巨噬细胞泡沫细胞组成的较大病变，但包含小的细胞外脂质池和第一次基质沉积，纤维帽动脉粥样硬化瘤(FCA)定义为具有透明纤维帽和坏死核心(细胞外脂质积聚、胆固醇晶体和/或钙化)的晚期动脉粥样硬化病变。在每个纤维帽的最薄部分测量纤维帽厚度。对MAC3(BDPharmingen)、α平滑肌肌动蛋白(Sigma-Aldrich)、CD3(AbD血清型)、CD8(eBioscience)、Ki67(Abcam)和TUNEL(原位凋亡检测试剂盒，罗氏)进行免疫组织化学。稳定性指数定义为(%αsmoothmuscleactin/%necroticcore)。用兔抗小鼠PFKFB3抗体(Abcam，AB)结合CD31(德国汉堡Dianova)和前面提到的MAC3、CD3和α平滑肌肌动蛋白进行双重免疫组织化学染色。形态计量分析在徕卡DM3显微镜上进行，显微镜配有DFC相机和AdobePhotoshopCS6、ImageJ或Las4.0软件(徕卡)。

6.流式细胞术脾和淋巴结均质化，血液和脾样品进行红细胞裂解。细胞用荧光标记的表面染色抗体(CD45、CD3、CD4、CD8、F4/80、Ly6C、Ly6G、MHCI、MHCII、CD44、CD62L、CD19、CD11C、NK1.1全部来自BD生物科学)。对于细胞内染色，用固定/透化缓冲液固定和透化细胞，并用抗Foxp3的荧光抗体染色。流式细胞分析是在英国医学科学院院刊二(英国医学科学院生物科学)上进行的。7.用共聚焦显微镜对小鼠主动脉进行免疫荧光染色

腹主动脉保持完整，用ICAM-1(Abcam)和VCAM-1(Abcam)进行正面染色，或在髂分叉前3-5毫米处切开主动脉，获得横切面。对于后者，主动脉被包埋在石蜡中，随后切割成10米切片进行免疫荧光染色。接下来，如前所述对横切面进行染色。总之，使用了以下抗体:ICAM-1(Abcam)、GLUT-1(ThermoFisher)和二级抗体AlexaFluor(PFKB3)和Alexa(GLUT1-1)(均为ThermoFisher)。HIF1α(RD系统公司，MAB)，GLUT3(Invitrogen，MA5-)，HIF1的二级AlexaFluor和GLUT3的AlexaFluor(均为ThermoFisherScientific)。主动脉的横切面用含有DAPI的DAKO安装介质固定(安捷伦，美国圣克拉拉)。所有样品都在徕卡TCSSP8共焦激光扫描显微镜上可视化，并使用ImageJ进行定量。

8.核糖核酸分离、cDNA合成和实时定量聚合酶链反应

用TriPure匀浆和裂解组织(瑞士巴塞尔罗氏公司)。根据制造商的说明分离RNA。简而言之，1克的核糖核酸被用于核糖核酸合成。使用SybrGreenFast(美国俄亥俄州辛辛那提市的BiolineMeridianBioscience)在ViiA7聚合酶链反应机器(荷兰布莱维斯维克应用生物系统公司)上进行定量聚合酶链反应。基因表达标准化为看家基因H36B4。引物序列见补充表1。所有基因表达图显示相对基因表达的倍数变化，其值被标准化为对照组的平均值。

表1动脉粥样硬化快速生物库纳入患者的临床特征

9.鼠PBMC分离和海马通量分析

小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)是通过使用淋巴制剂的密度离心从全血样品中获得的(干细胞技术，德国科隆；D=1.克/毫升)。用富含2mM乙二胺四乙酸的PBS以1:1的比例稀释血液，随后加入淋巴制剂层。接下来，细胞在室温下以×g离心20分钟，缓慢加速，无制动。收集PBMC馏分，用PBS/2mM乙二胺四乙酸洗涤两次。接下来，细胞计数使用卡西计数器(罗氏创新卡西TT，比勒菲尔德，德国)。接下来，将多溴联苯醚以每孔50，个细胞的密度接种在XFe96微孔板(海马生物科学)上的80LEGM-2培养基中。将细胞在无缓冲的DMEM分析培养基(默克)中于37℃在无二氧化碳的培养器中培养1.5小时。使用海马XFe96分析仪(海马生物科学公司，美国)分析细胞呼吸。注射葡萄糖(10mM)、线粒体/ATP合成酶抑制剂寡霉素(1.5M)和糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)后测量细胞外酸化率(ECAR)；mM)，分别测定糖酵解、糖酵解能力和糖酵解储备。对v值进行细胞计数校正。

结果RESULT1.巨噬细胞和内皮细胞中PFKFB3的表达与人动脉粥样硬化斑块不稳定性相关

颈动脉斑块取自动脉粥样硬化快速生物库登记的动脉内膜切除术患者。斑块分为纤维斑块(含10%斑块内脂肪)、纤维动脉粥样化(10-40%斑块内脂肪)或动脉粥样化(40%斑块内脂肪)。纤维动脉粥样化斑块和动脉粥样化斑块都具有增加的斑块易损性指数(表1)。进一步的颈动脉斑块分析显示，当斑块易损性较高时，PFKFB3的表达明显较高(图1A，B)。较高的PFKB3表达与粥样斑块中大量CD68+巨噬细胞一致(图1A，C)，与PFKB3表达呈正相关(图1D)。这些数据表明，主要是巨噬细胞在动脉粥样硬化斑块中表达增强。同样，人类冠状动脉粥样硬化斑块，组织学分类为纤维帽动脉粥样硬化(晚期动脉粥样硬化)，表达较高水平与内膜黄色瘤或病理性内膜增厚(初始/中间动脉粥样硬化)相比，PFKB3+细胞的数量(图1E，F)。PFKB3的表达与坏死核心面积呈正相关(图1G)，表明PFKB3的表达在动脉粥样硬化的进展过程中增加。大多数PFKB3+细胞是CD68+巨噬细胞和PECAM+内皮细胞(图1H，1)。只有少数CD3+T细胞和α平滑肌肌动蛋白(αSMA)+血管平滑肌细胞表达PFKFB3(图1J，K)。在小鼠斑块中观察到类似的表达，其中PFKFB3也主要在巨噬细胞(MAC3+)和内皮细胞(PECAM+)中观察到，在T细胞(CD3+)和平滑肌细胞(αSMA+)中观察到的程度较低(补充图1A-D)。这些数据表明，随着斑块变得更加脆弱，PFKFB3的表达增加。

图1.PFKFB3在晚期动脉粥样硬化斑块中的表达增加，并与CD68+巨噬细胞和坏死核心区相关。(A,B)与颈动脉纤维斑块相比，粥样斑块中PFKFB3(绿色)的表达增加。纤维和纤维粥样斑块n=10，粥样斑块n=8；单向方差分析，纤维斑块和动脉粥样斑块的P=0.。动脉粥样硬化性颈动脉斑块中比例尺50m(A,C)CD68+巨噬细胞(红色)增加。纤维和纤维粥样斑块n=10，粥样斑块n=8；单向方差分析，纤维斑块与动脉粥样硬化斑块的P=0.8。比例尺50m(D)PFKB3表达与CD68表达显著相关。n=28线性回归分析，R2=0.，P0.1(E)与初始斑块相比，人类冠状动脉粥样硬化晚期斑块显示PFKFB3表达增加。初始斑块n=4，晚期斑块n=5；双尾不成对曼-惠特尼，P=0.。比例尺m(F)PFKB3表达与坏死核心面积呈正相关。n=9；线性回归分析R2=0.，P=0.(G)PFKB3+与CD68+巨噬细胞共染色的免疫组织化学；比例尺m(H)PECAM+内皮细胞；比例尺m(I)CD3+T细胞；比例尺m(J)α平滑肌肌动蛋白(αSMA)+血管平滑肌细胞(K)；比例尺米数据显示为平均值的平均标准误差。*P0.05，**P≤0.，***P0.5。PFKFB3，6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-双磷酸酶3；血小板内皮细胞粘附分子PECAMαSMA。

2.PFKFB3抑制抑制动脉粥样硬化的进展并促进斑块稳定性

为了研究PFKB3抑制动脉粥样硬化的治疗潜力，6-8周龄的Ldlr?/?小鼠接受高脂肪饮食8周，随后用PFKB3抑制剂PFK治疗5周(腹膜内给药，每周3次，2毫克/千克)(图2A)。PFK处理对体重没有影响(图2B)。为了评估PFK的疗效，我们检测了PFK处理的小鼠的外周血单核细胞的代谢特征，其糖酵解和糖酵解能力显著降低(图2C)。PFK-治疗对血浆总胆固醇水平、血浆极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白水平没有影响(图2D)。外周血和淋巴器官中的免疫细胞分布不受PFK治疗的影响(补充图1E-H)。

虽然主动脉弓的动脉粥样硬化病变大小不受PFK治疗的影响(图2E，F)，但形态学分析表明，PFK治疗的小鼠主动脉弓包含相对较少的FCA(晚期动脉粥样硬化病变；图2G)。这伴随着PFK治疗后内膜黄色瘤(初始动脉粥样硬化病变)发病率的增加(图2G)，表明PFKFB3的抑制减轻了动脉粥样硬化的进展。有趣的是，在PFK处理的小鼠中，每个斑块的坏死核心面积(图2H)和斑块内细胞凋亡(图2I)都减少了，而CD4+和CD8+T细胞和增殖的Ki67+细胞的数量保持不变(分别为补充图2A-C)。此外，在PFK治疗的小鼠中观察到斑块巨噬细胞含量(Mac3+面积)增加的趋势(图2J)。PFK治疗导致血管平滑肌含量(αSMA+)(图2K，L)和纤维帽增厚(图2M)显著增加。这导致稳定斑块显著增加，如斑块稳定性指数增加所示(图2N)。在PFK治疗小鼠的主动脉根部观察到类似的动脉粥样硬化表型(补充图3A-F)。这些数据表明，PFKFB3的治疗抑制抑制动脉粥样硬化的进展，并促进斑块的稳定性。

图2.PFK阻碍动脉粥样硬化的进展并增加斑块稳定性。(A)实验设计:在8周的0.15%高胆固醇饮食后，雄性Ldlr小鼠(n=14/组)每周注射3次PFK或赋形剂，持续5周(总共13周的高脂肪饮食)。(B)PFK治疗对体重无明显影响。(C)对循环外周血单核细胞的分析显示，与PFK处理的对应细胞(n=8)相比，载体细胞(n=13)的细胞外酸化率增加，表明糖酵解抑制的有效性。双尾不成对学生的t检验P=0.7。n=10/组。(D)各组间血浆胆固醇水平保持相似。n=14/组(E，F)主动脉弓动脉粥样硬化病变面积无变化；比例尺=50m，n=10/组。(G)形态学分析(Virmani分类)显示PFK治疗小鼠主动脉弓中FCA的发生率降低。在PFK处理的小鼠中，内膜黄色瘤的发生率增加。卡方，P=0.。(H)在PFK治疗的小鼠(8只)与载体(9只)中，每晚期斑块的坏死核心面积减少。不成对学生的t检验P=0.。(I)PFK治疗(n=9)与载体(n=7)相比减少了凋亡(TUNEL+)细胞的数量。t双尾不成对曼-惠特尼，P=0.。(J)在PFK处理的小鼠中观察到巨噬细胞含量增加的趋势。双尾不成对学生测验P=0.。(K,L)PFK处理的小鼠(n=10)相对于载体处理的小鼠(n=9)增加αSMA含量；双尾不成对学生测验P=0.比例尺=50m)和(M)纤维帽厚度增加(n=10/组；t双尾不成对曼-惠特尼，P=0.)。(N)增加斑块稳定性指数(载体组n=8，PFK组N=9；t双尾不成对曼-惠特尼，P=0.)。数据显示为平均值的平均标准误差。*P0.05，**P0.，***P0.5。TC，总胆固醇；VLDL，极低密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；HDL，高密度脂蛋白；HE、苏木精、曙红；IX，初始黄色瘤；病理性内膜增厚；FCA，纤维帽状动脉粥样硬化；αSMA，α平滑肌肌动蛋白；PBMC，外周血单核细胞；ECAR，细胞外酸化率。

3.PFK不影响内皮的动脉粥样硬化表型

在PFK治疗后，没有观察到ICAM-1和VCAM-1表达的差异(图3A)。此前，已有研究表明，在PFK治疗后，动脉内皮细胞中GLUT1蛋白表达减少；然而，葡萄糖转运蛋白1的表达在各组主动脉的横截面中不受影响(图3B)。在PFK治疗后，观察到斑块中GLUT3(图3C)和HIF1α(图3D)均显著下调。且进一步观察到HIF1α和Glut3表达水平之间存在显著的正相关关系(图3E)，表明HIF1α和GLUT3水平通过PFKFB3介导的糖酵解进行调节，并且HIF1α和GLUT3水平的升高与增加斑块稳定性。且发现含斑块的主动脉弓匀浆表明PFK治疗确实导致炎症标记物Il1β的基因表达减少和Cd36的趋势。相反，PFK组的巨噬细胞标记物F4/80降低，同时Cd11c和Cd显著降低，表明交替激活的巨噬细胞含量较低(图3F)。在PFK处理后，还观察到G6pd转录物水平降低，G6PD是戊糖磷酸途径(PPP)中的第一个和限速酶，而Slc2a1、Slc2a3和糖酵解介质Pfkfb3没有被PFK处理改变(图3G)。类似地，参与TCA循环的Cs、Fh1以及参与脂肪酸氧化的Cpt1a没有被处理改变(图3H)。这些数据表明PFK治疗后在基因表达水平上主动脉弓斑块的炎症特征发生了改变。

图3.PFK改变高度血管化肺组织的表型，但不影响动脉内皮表型。(A)ICAM-1和VCAM-1在每张图像中的表达(每组n=50)和(B)GLUT1在内皮细胞中的表达在各组之间没有显著变化(载体组n=13，PFK组n=12)。(C)在PFK治疗后，GLUT3表达显著降低(两组均为4)，与降低一致。(D)缺氧诱导因子1α水平(车辆组n=5，PFK组n=6)。(E)缺氧诱导因子1α和葡萄糖转运蛋白3表达水平呈正相关(R2:0.，P:0.)。含斑块的主动脉弓匀浆显示了几个显著差异表达的基因。(F–H)双尾不成对学生T检验，Il1βP=0.，G6PDP=0.，F4/80P=0.，CD11cP=0.(每组n=3–4)。数据显示为平均值的平均标准误差。*P0.05。ICAM-1，细胞间粘附分子1；葡萄糖转运蛋白1，CTCF，校正的总细胞荧光

在这项研究中，首次发现人类颈动脉和冠状动脉斑块中PFKFB3的表达与不稳定斑块表型呈正相关。用低剂量糖酵解抑制剂靶向PFKFB3可减少Ldlr?/?小鼠中具有脆弱表型的晚期斑块，增加稳定斑块表型，同时降低循环PBMCs中的糖酵解流量。这些数据可能暗示了糖酵解抑制的动脉粥样硬化保护作用。

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