PIEZO1和GqG11根据血流模式和整

原文出处：

Albarrán-JuárezJ,IringA,WangS,JosephS,GrimmM,StrilicB,WettschureckN,AlthoffTF,OffermannsS.Piezo1andGq/G11promoteendothelialinflammationdependingonflowpatternandintegrinactivation.JExpMed.Oct1;(10):-.doi:10./jem.0483.EpubSep7.PMID:;PMCID:PMC.

研究背景：

动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种慢性、复杂的血管病变，是冠心病、脑血管病以及周围动脉疾病的病理基础和主要病因。目前为止，其发病机制尚未完全清楚，存在多种学说，涉及多种危险因素，临床缺乏有效的防治药物。

剪切力(shearstress,SS)是指血流与血管内皮间的摩擦作用于血管壁单位面积的力，也叫切应力，与血液特性、血流速度和血管形态有密切关系。层流(laminarflow)也叫恒流、层流剪切力(laminarshearstress,LSS)，指血液沿着与管轴平行的方向形成分层作同向平滑直线运动，流速在管中心处最大，其近壁处最小。扰流(disturbedflow)也叫湍流、振荡剪切力(oscillatoryshearstress,OSS)，血液的流线、流向紊乱并随机地出现波浪状的摆动。NF-κB在炎症、免疫、细胞增殖、分化以及存活过程中扮演重要角色，是一种重要的转录因子。低密度脂蛋白受体(LDLR)广泛分布于各种细胞和组织，如肝细胞、成纤维细胞、血管平滑肌细胞、淋巴细胞、单核细胞及肾上腺、卵巢等，它在肝脏和肾上腺皮质、睾丸、卵巢等甾源性组织的脂蛋白代谢中发挥重要作用，其主要功能是参与LDL的代谢。机械门控Piezo离子通道能够快速响应机械力刺激并介导阳离子流入细胞、进而诱发细胞兴奋和信号转导的一类重要离子通道，在哺乳动物中包括Piezo1和Piezo2。Piezo1被发现在多种细胞组织中作为机械力分子受体参与调控血管及淋巴管发育、血压稳态维持、骨的生成与重塑等诸多功能。研究表明，剪切力可以激活内皮细胞Piezo1，并且Piezo1参与了剪切力诱导的内皮细胞内钙内流和细胞排列。整合素(integrin)，又称为整联蛋白，是由α和β亚单位构成的跨膜蛋白，是细胞表面受体的主要家族。整合素的胞外结构域与ECM蛋白相互作用，胞质结构域与细胞内信号分子复合，并通过一系列连接蛋白与细胞骨架肌动蛋白物理连接。G蛋白偶联受体(GPCRs)是最大的一类膜蛋白家族受体，通过偶联下游异源三聚体G蛋白将信号从胞外传递至胞内。GPCR是人类基因组编码最大的膜蛋白超家族，也是最大的药物靶点。它们所介导和调控的细胞质信号级联反应在哺乳动物细胞功能的各个方面都起着非常关键的作用。流体剪切力可触发内皮细胞释放多种血管活性介质，其中由内皮型一氧化氮合酶(eNOS或NOS3)产生的一氧化氮(NO)被认为是主要的内皮血管舒张因子。血流量的急剧增加会导致短暂的细胞内[Ca2+]([Ca2+]i)升高，然后以Ca2+/钙调蛋白依赖的方式激活eNOS。

动脉粥样硬化常发生在血液流动受到干扰的动脉弯曲处、分叉处，而处在高层流环境中的区域则对动脉粥样硬化的发展表现出较大的抵抗作用。多项证据表明，高层流和扰流在内皮细胞中诱导不同的信号转导过程，分别导致抗动脉粥样硬化和促动脉粥样硬化的表型。不同的血流对内皮细胞的形态有很大的影响，高层流剪切力区域的内皮细胞沿流动方向伸长排列，而扰流区域的内皮细胞无此表现。在持续层流下的细胞只在细胞轴的方向上接受流动，而扰流区域的细胞是随机定向的，并暴露在许多不同角度的血流中。研究表明，内皮细胞对血流的反应是由血流相对于内皮细胞形态和细胞骨架轴的流动方向决定的。经预流诱导排列的内皮细胞暴露在沿细胞轴方向的层流中时，eNOS活性最大，而当流向垂直于细胞轴时，检测不到eNOS的激活。相反，NF-κB的激活在90度时最大，当细胞接受平行于细胞轴的流动时检测不到。

研究结果

1：Piezo1和Gq/G11介导扰流诱导的内皮炎症

为了检测Gq/G11介导的信号在扰流诱导的炎症信号激活中的作用，作者将人脐动脉内皮细胞暴露在振荡血流中。用干扰(对照)siRNA、针对Piezo1、P2Y2或G-αQ和G-α的siRNA转染融合的人脐动脉内皮细胞。第二次转染24h后，使用流动室(A和C-F)或锥板粘度计(B)在指定的时间段(A)内流动(4dynes/cm2，1Hz)，使细胞在无流或低振荡的情况下继续生长。Westernblot结果显示，在P2Y2以及GαQ和Gα11被阻断后，磷酸化的P65明显减少，表明扰流诱导的炎症信号被阻断（图1A）。同样在(图1A)中，敲除piezo1后，获得了非常相似的数据，表明piezo1通过介导流动诱导的内皮ATP释放而在P2Y2和Gq/G11的上游起作用。作者发现，在静止条件或振荡流条件下保持的人脐动脉内皮细胞上清液中ATP的浓度,结果显示扰流也依赖于Piezo1诱导内皮细胞释放ATP（图1B），进而激活下游Gq/G11偶联的嘌呤能P2Y2受体。

接着在图1C和图1D中，作者用抗p65抗体对细胞进行染色，确定细胞p65的定位。免疫共聚焦结果显示，对照组中扰流48h相比静止环境下，P65发生了明显的核转位，而沉默Piezo1组及沉默GαQ/Gα11组中，扰流与静止环境下的P65定位未见明显改变，这说明扰流作用48h不能诱导沉默Piezo1或GαQ/Gα11的内皮细胞中p65的核转位（图1C,D），这与Piezo1、P2Y2和Gq/G11在内皮NF-κB活化中的作用一致。

由于NF-κB在内皮细胞中的激活已被证明可以诱导白细胞粘附分子的表达，作者检测了Piezo1或GαQ/Gα11基因敲除是否会影响VCAM-1的表达。当人脐动脉内皮细胞暴露于扰流48h后，如(图1E和图S1B)所示，使用westernblot检测VCAM-1的免疫反应性，使用qPCR检测其mRNA表达水平，在对照组中可以观察到VCAM-1及其mRNA表达明显上调。在敲除Piezo1或GαQ/Gα11后，VCAM-1及其mRNA表达明显下调(图1E和图S1B)。在扰流诱导的其他炎症基因的上调上也观察到了类似的结果，如编码CCL2和PDGFB的基因(图S1C和D)。由于内皮细胞和单核细胞黏附与动脉硬化的发生密切相关，在(图1F)中，作者将HUAECs预先暴露于振荡流中48h，并与荧光标记的THP-1细胞在37°C孵育30min。免疫共聚焦结果显示，在Piezo1或GαQ/Gα11被敲除后，暴露于扰流48h的Thp-1单核细胞（人髓系白血病单核细胞）与内皮细胞的粘附显著降低(图1F)。以上结果表明，Piezo1和Gq/G11不仅介导层流诱导的内皮细胞抗动脉粥样硬化信号，而且在体外也介导扰流诱导的炎性内皮细胞活化。

图1

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2:内皮Piezo1和Gq/G11缺乏导致内皮炎症减轻和动脉粥样硬化进展减缓

作者使用他莫昔芬诱导的内皮特异性G-αQ/G-α11-、P2Y2-或Piezo1缺陷小鼠，在体内条件下，检测Piezo1、P2Y2和GQ/G11是否介导了血流诱导的内皮炎症紊乱。如（图S2，A和B；图S3，A和C）所示，作者使用DAPI和抗CD31（标记内皮细胞）、抗CD68（标记巨噬细胞）、抗VCAM-1（内皮炎性指标）抗体染色，使用免疫共聚焦显微镜观察暴露于连续层流的主动脉弓外弯，结果显示内皮特异性Piezo1、P2Y2或Gαq/Gα11缺陷小鼠的内皮细胞形态、Vcam-1表达或Cd68阳性细胞数量没有明显差异。然而，在（图2、A和B；以及图3、B和C）中，主动脉弓内弯处自然暴露在致动脉粥样硬化扰流中的内皮细胞中，VCAM-1表达的增加和CD68阳性细胞的数量在内皮细胞Piezo1、P2Y2或G-αQ/G-α11沉默后显著减少。

（图S4A）通过qPCR检测VCAM-1的mRNA表达水平，观察到内皮特异性Gαq/Gα11-和Piezo1缺陷小鼠中主动脉弓内曲的VCAM-1表达减少。（图S4B）使用流式细胞仪检测Cd11c（纤维蛋白原受体）阳性细胞的数量，发现内皮特异性Gαq/Gα11-和Piezo1缺陷小鼠中主动脉弓内曲Cd11c阳性细胞的数量明显减少（Cd11c阳性细胞如单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞，已被证明存在于主动脉的易动脉粥样硬化区域，其减少反映了Cd68阳性细胞数量的减少）。为了研究内皮Piezo1、P2Y2和Gq/G11在动脉粥样硬化形成中的作用，作者进行了部分颈动脉结扎（一种急性诱导的血流紊乱和层流减少导致内皮功能障碍和动脉粥样硬化的模型）。在（图2C和图S4C）中，作者使用低密度脂蛋白受体缺陷的小鼠，诱导内皮特异性Piezo1或Gαq/Gα11缺乏，在颈动脉部分结扎2周后，与单纯LDL受体缺陷小鼠（对照组）相比，Vcam-1表达明显减少，表明内皮炎症显著减轻（图S4C显示所有小鼠均给予高脂饮食并保持总胆固醇水平一致）。（图2D和S3D）颈动脉弹性纤维染色结果表明，颈动脉部分结扎后4周，LDL受体缺陷小鼠中内皮特异性缺乏piezo1、P2Y2或Gαq/Gα11的小鼠与单纯LDL受体缺陷小鼠相比，其新生内膜明显缩小。

另外，作者在长期动脉粥样硬化模型中也进行了类似的观察。在高脂饮食喂养LDL受体缺陷小鼠16周后，对小鼠主动脉进行石蜡切片并进行苏丹红染色和弹性染色。结果显示与对照LDL受体缺陷小鼠相比，LDL受体缺陷的内皮特异性piezo1或Gαq/Gα11缺陷小鼠的主动脉、主动脉根部以及无名动脉中动脉粥样硬化斑块的发生和进展明显减少（图3，A–C；以及图S4、C和D）。（图S4D的流式细胞结果中，Cd45+/Cd11b+/Ly6clow表示巨噬细胞，Cd45+/Cd11b+/Ly6chigh表示单核细胞，结果表明外周血中两者在三组无明显差别）。以上结果表明，内皮Piezo1和Gq/G11缺乏可以使内皮炎症减轻以及动脉粥样硬化进展减缓。

图2

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3:内皮Piezo1和Gq/G11根据血流模式介导动脉粥样硬化保护或动脉粥样硬化信号转导

为了能够清楚地区分内皮细胞对层流和扰流的反应，作者首先通过将内皮细胞暴露在层流中24小时来预流内皮细胞，使细胞沿流动方向上排列。此后，然后再将细胞暴露在高层流中以诱导动脉粥样硬化保护信号，或者暴露在高频振荡流或流向改变90度以致诱导动脉粥样硬化信号。如(图4A)所示，扰流即是由高频振荡流或改变流向90度引起的。(图4B)中，当预流对照细胞经过1h低层流暴露后再次暴露在高层流中时，将针对Gαq/11的siRNA转染人脐动脉内皮细胞并于对照组对比，westernblot结果可以观察到eNOS磷酸化增加，磷酸化P65表达较低且没有差异（表明NF-κB没有被激活），且Iκ-Bα降解。相反，如（图4C和D）所示，在预流细胞中，振荡流和垂直于形态细胞轴的流都导致NF-κB的强烈激活（磷酸化P65与对照组有明显差异），而eNOS磷酸化水平较低且没有差异。这些结果表明，GαQ/Gα11的敲除不仅阻断了层流诱导的eNOS磷酸化(图4B)，而且还阻断了扰流诱导的炎症信号(图4，C和D)，在敲除Piezo1(图5，A和B)后也观察到了同样的结果。以上数据表明，在预流内皮细胞中，不同的下游信号过程是通过Piezo1和Gq/G11介导的，这取决于施加的流动模式。

图4

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4:整合素通过Piezo1和Gq/G11被不同的血流模式差异激活

由于已经证明流诱导的内皮NF-κB激活是由整合素α5β1或αvβ3介导的，并且需要整合素下游的粘着斑激酶（FAK），因此以FAK的磷酸化作为判断整合素激活的标志。作者测试了层流和扰流对预流内皮细胞FAK磷酸化的影响（图6A-E）。在（图6A和图6D）中，对照组内高层流相比低层流，westernblot结果显示p-FAK水平明显减少，表明层流降低了FAK的活性。(图6B和图6C)的对照组内，振荡流或90°流与层流相比，p-FAK水平显著上升，表明扰流能诱导FAK的激活。在Gαq和Gα11(图6，B和C)和Piezo1(图6E)被敲除后，与对照组相比，p-FAK水平在振荡流和90°流中没有差异，表明Gαq和Gα11以及Piezo1的敲除阻断了扰流引起的FAK激活。接着，在(图6F和G)中，作者用磷酸化FAK抗体(Y，绿色)、内皮标志物CD31(红色)和DAPI(蓝色)对主动脉弓内、外曲横断面进行染色。LDL受体缺陷小鼠主动脉弓的免疫组织化学分析显示，与外曲相比，内曲的内皮细胞中FAK的磷酸化显著增加。同样在(图6，F和G)中，内皮特异缺失Piezo1或G-αQ/G-α11的LDL受体缺陷小鼠中，主动脉内曲增加的p-FAK显著减少。这也表明Gαq和Gα11以及Piezo1的敲除阻断了主动脉弓内曲（自然暴露于扰流中）的FAK激活。

为了区分整合素α5和整合素αv的参与，作者用针对ITGA5（α5）和ITGAV（αv）干扰siRNA转染HUAECs，以敲除了其中一个整合素α亚基的表达。如图7A中westernblot结果所示，与对照组相比，敲除整合素α5后，扰流下表达的p-FAK和p-65明显下降，而敲除整合素αv无影响，结果与对照组相似。同样，在(图S5A)中，用ATN（α5β1整合素阻断剂）阻断α5β1整合素，抑制了扰流诱导的FAK和p65的磷酸化。而用S（αvβ3整合素阻断剂）阻断αvβ3整合素后，与对照组相比结果没有差别。这表明，整合素α5β1参与了扰流诱导的动脉硬化炎症过程（NF-κB的激活）。在（图7B和C）中，为了更直接地研究血流模式依赖的整合素激活，作者使用识别整合素α5活化形式的抗体进行免疫共沉淀。结果表明整合素α5在扰流时被激活，在层流时反而下降，并且与对照组相比，Gαq/Gα11的敲除阻止了扰流对整合素的激活（图7C）。

用针对活性整合素α5的抗体SNAKA51对LDL受体缺陷小鼠主动脉弓切片进行染色，该抗体也识别活化的小鼠整合素α5（图S5，B–E）。在（图7D）中，作者对喂饲高脂饲料4wk的LDL受体缺陷小鼠的主动脉弓内、外曲横断面分别用抗活化α5整合素抗体(SNAKA51；绿色)、抗内皮标志物CD31抗体(红色)和抗DAPI抗体(蓝色)进行免疫组织化学染色，结果显示在单纯LDL受体缺陷小鼠的对照组中，内曲处内皮细胞的整合素激活比外曲内皮细胞明显增加。同样（图7D）中，在LDL受体缺陷并诱导内皮特异性Piezo1或GαQ/Gα11缺陷的小鼠中，与对照组（单纯LDL受体缺陷小鼠）相比，主动脉内弯处增加的内皮整合素活性明显降低。在（图5SB-E）中，用对照siRNA或针对小鼠整合素α5(ITGA5)的siRNA转染小鼠肺内皮细胞(MLEC)，在IBIDI流室系统中静置或振荡培养24h。然后用活化的α-5整合素抗体(SNAKA51；绿色)和DAPI(蓝色)对细胞进行免疫染色。阴性对照只用二抗和DAPI孵育。可以看到，扰流诱导的活化α5整合素在被siRNAITGA5阻断后，其表达明显减少。以上结果表明，只有扰流才能诱导整合素的激活，而且在体内条件下，血流紊乱区域的内皮细胞也表现出Piezo1和GQ/G11依赖的整合素活化和FAK磷酸化的增加。

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结论：

层流和扰流分别诱导的动脉粥样硬化保护信号和致动脉粥样硬化信号均涉及Piezo1、P2Y2和Gq/G11介导的信号。当该信号级联被层流激活时，会促进动脉粥样硬化保护的下游信号，如eNOS的激活。当被扰流激活时，会诱导整合素的激活，进而诱导下游包括NF-κB激活在内的促炎信号过程。